豬繁殖與呼吸綜合征病毒RT-PCR檢測試劑盒

發布時間：2014-01-23 13:59:21

用途

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）反轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）檢測試劑盒，用於檢測疑似感染動物的血清或組織中的PRRSV，適用於PRRSV的檢測、診斷和流行病學調查。

原理

利用離心柱內矽基質膜提取RNA，在反轉錄酶的作用下，以 RNA為模板，引物為起點合成與RNA模板互補的cDNA鏈。在 TaqDNA聚合酶的作用下，經高溫變性、低溫退火、中溫延伸的循環，使特異 DNA片段的拷貝數放大一倍。經過 35次循環，最終使擴增 DNA片段放大了數百萬倍。將擴增 DNA片段進行電泳，經染色後，在紫外燈照射下，肉眼可見到 DNA片段的擴增帶。

試劑盒組成

*洗液Ⅰ首次使用前，請添加2.5ml（10頭份）/5ml（20頭份）100%乙醇。

*洗液Ⅱ首次使用前，請添加7ml（10頭份）/14ml（20頭份）100%乙醇。

需要自備的器材及試劑

器材：PCR擴增儀、電泳係統、紫外凝膠成像儀、可調移液器（2.5µl、10µl、200µl、1000µl）、離心機、微波爐、一次性RNase Free吸頭（10µl、200µl、1000µl）、RNase Free 1.5ml離心管、0.2mlPCR管。

試劑：瓊脂糖、Marker、核酸染色液、TAE電泳緩衝液、PBS液（0.01M,pH7.2-7.4）。

使用注意事項

所有接觸病料的物品均應合理處理，以免造成人員傷害及汙染實驗室。

所有試劑應在規定的溫度儲藏，-20℃保存的各試劑使用前應放於室溫完全融化，使用後立即放回-20℃。

嚴格遵守操作說明可以獲得良好的結果。操作過程中移液、定時等全部過程必須精確。

反複凍融試劑將減低檢測靈敏度，建議在3次內用完，請嚴格按照試劑盒說明書操作。

樣品製備

       1樣品采集：病死或撲殺的豬、死亡胎兒等，取肺、扁桃體、脾髒和淋巴結等組織；待檢活豬，用注射器取血5ml。2～8℃保存，送實驗室檢測。（要求送檢病料新鮮，嚴禁反複凍融。）

2樣品處理：每份樣品分別處理。

2.1組織樣品處理：每份組織分別從三個不同位置稱取樣品約3g，用手術剪剪碎混勻後，按照1:4加入PBS液於研磨器中研磨，勻漿後4℃8000×g離心2min，取上清液200µl於1.5ml滅菌離心管（自備）中。

       2.2全血樣品處理：待血凝後取血清200µl，置1.5ml滅菌離心管（自備）中。

       2.3陽性對照處理：取陽性對照200µl，置1.5ml滅菌離心管（自備）中。

       2.4陰性對照處理：取陰性對照200µl，置1.5ml滅菌離心管（自備）中。

操作步驟

       1 病毒 RNA提取

       1.1 取已處理的樣品、陽性對照和陰性對照，分別加入200µl試劑Ⅰ，劇烈震蕩混勻，室溫放置3-5min。

       1.2 加入75µl試劑Ⅱ，混合均勻後，4℃ 12000×g離心3-5 min。

       1.3 將上清液轉移到新的2ml收集管中，加入300µl異丙醇，上下顛倒混勻。

    1.4 將混勻液轉移至吸附柱中（提前將吸附柱安置於另一新的2ml收集管中），4℃ 12000×g離心1 min，棄濾液。注：若吸附柱中有液體殘留，可重複離心1 min。

        1.5 加入500µl洗液Ⅰ至吸附柱中， 4℃ 12000×g離心1 min，棄濾液。

    注：請確認洗液Ⅰ中已經加入了指定體積的100%乙醇。

    1.6 加入800µl洗液Ⅱ至吸附柱中，4℃ 12000×g離心1 min，棄濾液。將吸附柱放回2ml收集管中,4℃ 12000×g離心1 min。注：請確認洗液Ⅱ中已經加入了指定體積的100%乙醇。

    1.7 將吸附柱安置於新的1.5ml的離心管（自備）中，在吸附柱膜的中央處加入50µl洗脫液，室溫靜置3 min，4℃ 12000×g離心1 min洗脫病毒RNA。注：溶解的RNA應置於-20℃或者更低溫度環境下保存。

       2 RT-PCR操作程序

   25µl體係: 使用前每份中分別加入21µl RT-PCR反應液、1µl酶混合液和3µl“1.7”中

         提取的模板RNA（注：使用時可根據情況適當稀釋），混勻後按照以下程序進行PCR擴增：

50℃     30min

95℃     3min

94℃     50s

55℃     50s       35個循環

72℃     1min

72℃     10min。

   3 電泳

稱2g瓊脂糖於250ml錐形瓶中，加入TAE電泳緩衝液200ml，於微波爐中熔解，再加入10µl核酸染色液混勻。在電泳槽內放好梳子，倒入瓊脂糖凝膠，待凝固後將PCR擴增產物10µl、Marker適量點樣於瓊脂糖凝膠孔中，以110-120V電壓於TAE電泳緩衝液中電泳30min，紫外燈下觀察結果。

  結果判定

陽性對照在421bp和511bp處出現擴增帶、陰性對照無帶出現（引物帶除外）時，實驗結果成立。被檢樣品在421bp處出現擴增帶為豬繁殖與呼吸綜合征變異株病毒陽性，或在511bp處出現擴增帶為豬繁殖與呼吸綜合征病毒經典株陽性，否則為陰性。

 附：本試劑盒A盒中附贈的TAE電泳緩衝液，使用時用雙蒸水或去離子水50倍稀釋後使用。